Produk
Kit Pengesanan SARS-Cov-2-RT-PCR Lifecosm untuk 2019-nCoV
Jangkaan penggunaan
Kit ini digunakan untuk pengesanan kualitatif coronavirus baharu (2019-nCoV) menggunakan swab kerongkong, swab nasofaring, cecair lavage bronchoalveolar, sputum. Hasil pengesanan produk ini hanya untuk rujukan klinikal, dan ia tidak boleh digunakan sebagai satu-satunya bukti untuk diagnosis dan rawatan klinikal.Analisis komprehensif keadaan disyorkan dalam kombinasi dengan manifestasi klinikal pesakit dan ujian makmal lain.
Prinsip pemeriksaan
Kit ini berdasarkan teknologi RT-PCR satu langkah.Malah, gen ORF1ab dan N coronavirus baharu (2019-nCoV) 2019 telah dipilih sebagai kawasan sasaran amplifikasi.Primer dan probe pendarfluor khusus (probe gen N dilabelkan dengan FAM dan probe ORF1ab dilabelkan dengan HEX) direka untuk mengesan RNA coronavirus jenis baharu 2019 dalam sampel.Kit ini juga termasuk sistem pengesanan kawalan dalaman endogen (probe gen kawalan dalaman berlabel CY5) untuk memantau proses pengumpulan sampel, penguatan RNA dan PCR, dengan itu mengurangkan keputusan negatif palsu.
Komponen utama
| Komponen | Kelantangan（48T/Kit） |
| Penyelesaian tindak balas RT-PCR | 96µl |
| nCOV primer TaqMan probemixture（ORF1ab,N Gen,RnaseP Gen） | 864µl |
| Kawalan negatif | 1500µl |
| nCOV Kawalan positif（l ORF1ab N Gen） | 1500µl |
Reagen sendiri: Pengekstrakan RNA atau reagen penulenan.Kawalan negatif/positif: Kawalan positif ialah RNA yang mengandungi serpihan sasaran, manakala kawalan negatif ialah air bebas asid nukleik.Semasa penggunaan, mereka harus mengambil bahagian dalam pengekstrakan dan harus dianggap berjangkit.Ia harus dikendalikan dan dilupuskan mengikut peraturan yang berkaitan.
Gen rujukan dalaman ialah gen RnaseP manusia.
Keadaan penyimpanan dan tarikh luput
-20±5 ℃, elakkan pembekuan dan pencairan berulang lebih daripada 5 kali, sah selama 6 bulan.
Instrumen yang berkenaan
Dengan FAM / HEX / CY5 dan instrumen PCR pendarfluor berbilang saluran lain.
Keperluan spesimen
1. Jenis spesimen yang berkenaan: sapuan tekak, sapuan nasofaring, cecair lavage bronchoalveolar, kahak。
2. Pengumpulan spesimen (teknik aseptik)
Swab pharyngeal: Lap tonsil dan dinding pharyngeal posterior dengan dua swab pada masa yang sama, kemudian rendam kepala swab dalam tabung uji yang mengandungi larutan pensampelan
Kahak: Selepas pesakit mengalami batuk yang mendalam, kumpulkan kahak yang batuk dalam tabung uji penutup skru yang mengandungi larutan pensampelan;cecair lavage bronchoalveolar：Pensampelan oleh profesional perubatan.3. Penyimpanan dan pengangkutan sampel
Spesimen untuk pengasingan virus dan ujian RNA perlu diuji secepat mungkin.Spesimen yang boleh dikesan dalam masa 24 jam boleh disimpan pada suhu 4℃;yang tidak dapat dikesan dalam tempoh 24
jam hendaklah disimpan pada -70 ℃ atau di bawah (jika tiada keadaan penyimpanan -70 ℃, ia hendaklah
disimpan sementara di -20 ℃ peti sejuk).Spesimen harus mengelakkan pembekuan dan pencairan berulang semasa pengangkutan.Spesimen hendaklah dihantar ke makmal secepat mungkin selepas pengumpulan.Jika sampel perlu diangkut dalam jarak yang jauh, penyimpanan ais kering disyorkan.
Kaedah Ujian
1 Pemprosesan sampel dan pengekstrakan RNA (kawasan pemprosesan sampel)
Adalah disyorkan untuk mengambil 200μl sampel cecair untuk pengekstrakan RNA.Untuk langkah pengekstrakan yang berkaitan, rujuk kepada arahan kit pengekstrakan RNA komersial.Baik yang negatif mahupun negatif
kawalan dalam kit ini terlibat dalam pengekstrakan.
2 Penyediaan reagen PCR (kawasan penyediaan reagen)
2.1 Keluarkan semua komponen dari kit dan cairkan dan gaul pada suhu bilik.Empar pada 8,000 rpm selama beberapa saat sebelum digunakan;hitung jumlah reagen yang diperlukan, dan sistem tindak balas disediakan seperti yang ditunjukkan dalam jadual berikut:
| Komponen | N hidangan (sistem 25µl) |
| nCOV primer probemixture TaqMan | 18 µl × N |
| Penyelesaian tindak balas RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = bilangan sampel yang diuji + 1 (kawalan negatif) + 1 (nCOVkawalan positif) | |
2.2 Selepas mencampurkan komponen dengan teliti, sentrifuge untuk masa yang singkat untuk membiarkan semua cecair pada dinding tiub jatuh ke bahagian bawah tiub, dan kemudian aliquot sistem penguatan 20 µl ke dalam tiub PCR.
3 Persampelan (kawasan penyediaan spesimen)
Tambah 5μl kawalan negatif dan positif selepas pengekstrakan.RNA sampel yang akan diuji ditambah ke dalam tiub tindak balas PCR.
Tutup tiub dengan ketat dan sentrifuge pada 8,000 rpm selama beberapa saat sebelum memindahkannya ke kawasan pengesanan amplifikasi.
4 amplifikasi PCR (kawasan pengesanan diperkuat)
4.1 Letakkan tiub tindak balas dalam sel sampel instrumen, dan tetapkan parameter seperti berikut:
| pentas | Kitaran nombor | Suhu(°C) | Masa | koleksitapak |
| terbaliktranskripsi | 1 | 42 | 10min | - |
| Pra-denaturasin | 1 | 95 | 1 minit | - |
| Kitaran | 45 | 95 | 15s | - |
| 60 | 30-an | pengumpulan data |
Pemilihan saluran pengesanan instrumen: Pilih saluran FAM、HEX、CY5 untuk isyarat pendarfluor.Untuk rujukan pendarfluor TIADA, sila jangan pilih ROX.
5 Analisis keputusan (Sila rujuk kepada arahan percubaan setiap instrumen untuk tetapan)
Selepas tindak balas, simpan hasilnya.Selepas analisis, laraskan nilai permulaan, nilai akhir, dan nilai ambang garis dasar mengikut imej (pengguna boleh melaraskan mengikut situasi sebenar, nilai permulaan boleh ditetapkan kepada 3~15, nilai akhir boleh ditetapkan kepada 5~20, pelarasan) dalam graf logaritma Pada ambang tetingkap, garis ambang berada dalam fasa logaritma, dan lengkung penguatan kawalan negatif ialah garis lurus atau di bawah garis ambang).
6 Kawalan kuantiti（Kawalan prosedur disertakan dalam ujian） Kawalan negatif:Tiada lengkung amplifikasi yang jelas untuk saluran pengesanan FAM, HEX, CY5n
Kawalan positif COV: lengkung penguatan yang jelas bagi saluran pengesanan FAM dan HEX, nilai Ct≤32, tetapi tiada lengkung penguatan saluran CY5;
Keperluan di atas mesti dipenuhi serentak dalam eksperimen yang sama;jika tidak, percubaan itu tidak sah dan perlu diulang.
7 Penentuan keputusan.
7.1 Jika tiada lengkung amplifikasi atau nilai Ct> 40 dalam saluran FAM dan HEX sampel ujian, dan terdapat lengkung amplifikasi dalam saluran CY5, ia boleh dinilai bahawa tiada coronavirus baharu 2019 (2019-nCoV) RNA dalam sampel;
.2 Jika sampel ujian mempunyai lengkung amplifikasi yang jelas dalam saluran FAM dan HEX, dan nilai Ct ialah ≤40, ia boleh dinilai bahawa sampel itu positif untuk coronavirus baharu 2019 (2019-nCoV).
7.3 Jika sampel ujian mempunyai lengkung amplifikasi yang jelas hanya dalam satu saluran FAM atau HEX, dan nilai Ct ialah ≤40, dan tiada lengkung amplifikasi dalam saluran lain, keputusannya perlu diuji semula.Jika keputusan ujian semula adalah konsisten, sampel boleh dinilai sebagai positif untuk yang baharu
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Jika keputusan ujian semula adalah negatif, ia boleh dinilai bahawa sampel itu negatif untuk coronavirus baharu 2019 (2019-nCoV).
Nilai pertimbangan positif
Kaedah keluk ROC digunakan untuk menentukan nilai rujukan CT bagi kit dan nilai rujukan kawalan dalaman ialah 40.
Tafsiran keputusan ujian
1.Setiap eksperimen perlu diuji untuk kawalan negatif dan positif.Keputusan ujian hanya boleh ditentukan apabila kawalan memenuhi keperluan kawalan kualiti
2. Apabila saluran pengesanan FAM dan HEX adalah positif, keputusan daripada saluran CY5 (saluran kawalan dalaman) mungkin negatif disebabkan oleh persaingan sistem.
3. Apabila keputusan kawalan dalaman negatif, jika saluran pengesanan FAM dan HEX tabung uji juga negatif, , ia bermakna sistem dilumpuhkan atau operasinya salah, ujian itu tidak sah.Oleh itu, sampel perlu diuji semula.
